Környezeti DNS módszerek a biodiverzitás-monitoringban

A legtöbb létező nem invazív környezeti DNS kutatás egyetlen fajra koncentrál. Ezek általában nagyméretű, ritka gerincesek (medve, farkas, vadmacska, hiúz, hód stb.), vagy invazív fajok és betegségek. A nagy gerincesek esetében a vizsgálatok gyakran az informált menedzsment érdekében folynak (1, 2). Az invazív fajok és betegségek esetében (pl. egzotikus halak, rákpestis) a cél a gyors előrejelzés (3, 4). A jelenlegi környezeti DNS kutatások többsége célzott és fajspecifikus polimeráz láncreakción (PCR) alapul. A módszer nagy előnye, hogy viszonylag egyszerű, olcsó, és nem igényel intenzív adatfeldolgozást. Például a rákpestis kimutatására optimalizált PCR csak akkor működik, ha a betegséget okozó moszatgomba DNS-e jelen van a vízben: a kimutatáshoz nincs szükség a DNS szekvenálására. A célzott környezeti DNS kutatások további előnye, hogy nagyon érzékenyek, mára már jól megalapozott módszertanuk van, kvantitatívak (megadják a célmolekula koncentrációját) és nem destruktívak. Viszont minden faj számára új tesztet kell kidolgozni és így több célfaj esetében a tesztek hamar költség- és idő-intenzívvé válnak. A mikrofluidika gyors fejlődésével elképzelhetőnek tartom, hogy megjelennek olyan vizsgálati módszerek, amelyek egyszerű szerkezetű közösségekre koncentrálnak (néhány tucat faj, pl. (5). Invazív erdészeti feromoncsapdával fogott kártevők például nagyon jó célpontjai lehetnek egy mikrofluidikán alapuló fajspecifikus módszernek, de nem invazív, vízalapú kétéltű- vagy halmonitoring esetében is elképzelhetőnek tartom a használatukat. Több száz, több ezer potenciális fajból álló közösségek jellemzésére, monitoringjára ezek a módszerek a közeljövőben valószínűleg nem lesznek alkalmasak.
Az új-generációs, párhuzamos DNS-szekvenálási módszerek tették lehetővé a taxonómiailag átfogó, nem fajspecifikus környezeti DNS-alapú felméréseket. A legtöbb létező, gerincteleneket célzó kutatás ugyanakkor destruktív és főleg csapdaanyagokat dolgoz fel. Ennek ellenére érdemes ezekről a módszerekről beszélni, mert hasonlóan működnek, mint a nem invazív módszerek, csak azoknál jóval kidolgozottabbak. Az új DNS-szekvenátorok egyszerre akár több millió DNS molekulát is leolvasnak egy komplex környezeti levesből (innen a nevük is: massively parallel, next-generation sequencing, NGS). Így nemcsak egy-egy fajt jelezhetünk a környezeti DNS-maradványok alapján, hanem bonyolult közösségeket is leírhatunk. A kutatások elsősorban taxonspecifikus genetikai vonalkódokat („barcode”) használnak (www.barcodeoflife.org/, (6)). A metabarcoding kutatások során polimeráz-láncreakció segítségével a környezeti DNS-kivonatban megsokszorozzuk a taxonómiailag informatív vonalkódot. Az amplifikált DNS-keverékből a szekvenátor párhuzamosan leolvassa az akár több millió fajspecifikus molekulát. A leolvasott szakaszokat hasonlóságuk szerint csoportosítjuk, esetleg összehasonlítjuk őket egy adatbázissal és ebből következtetünk a közösség szerkezetére.
A szekvenálási és adatfeldolgozási módszerek fejlődésével a metabarcoding kutatások egyre vonzóbbá és elérhetőbbé válnak. Néhány évvel ezelőtt a metabarcoding szinte csak a nehezen jellemezhető mikrobiális közösségekre koncentrált (pl. az emberi bélflóra (7), vagy növény-asszociált gombák (8)). Mára egyre nagyobb az érdeklődés az ökológiában és a biodiverzitás-monitoringban is a módszer iránt (9). A cél elsősorban az, hogy a hosszadalmas, nagy taxonómiai tudást és sok munkaórát igénylő mintafeldolgozást leegyszerűsítsük. Az egyik nagyon jó és viszonylag régi példa erre a folyóvízi bioindikáció (pl. (10)). Az Amerikai Egyesült Államok környezetvédelmi ügynökségének erre külön programja is van. Minden előnyük mellett a metabarcoding kutatásokkal számos új probléma is felmerül (egy jó összefoglaló itt: (11)). A vonalkód-szakasz amplifikációja pl. nem működik egyformán minden faj esetében, és ez befolyásolja a közösségről, az egyes fajok relatív gyakoriságáról kapott képet. A szekvenálási hibák miatti előforduló vonalkód-változatokat nagyon nehéz elkülöníteni a ritka biodiverzitástól. Az összehasonlításra használt adatbázisok hiányosak. A metabarcoding-kutatások validációja önmagában is egy nagyon érdekes probléma. Egy közösség DNS-alapú rekonstrukciója valószínűleg sosem fogja teljesen tükrözni az egyed-alapú monitoring-módszerek eredményeit, de ez nem is meglepő. A két megközelítés viszont ugyanazt a választ adhatja a természetvédelemben fontos menedzsment-kérdésekre (pl. (9)). A metabarcoding viszont jóval gyorsabb, egyszerűbb és olcsóbb a megfigyelés-alapú monitoringnál, és emiatt hamarosan fontossá válhat a természetvédelmi döntéshozásban (9). Ráadásul a két módszer nagyon jól ki is egészíti egymást. Hajibabaei és mtsai (12) pl. vízi makrogerinctelen-közösségeket határoztak meg a minták konzerválására használt alkoholban található DNSből. Így az összes egyed megmarad egy későbbi morfológiai alapú hitelesítéséhez.
Az invazív metabarcodinggal szemben még csak nagyon kevés nem destruktívan mintavételező kutatás létezik. Ezek főleg természetvédelmi jelentőségű fajokkal, gerincesekkel foglalkoznak. Az általam ismert munkák hatékonyan gyűjtögető organizmusokat (ragadozókat, parazitákat, dögevőket) „használnak” mintagyűjtésre. Calvignac-Spencer és mtsai (13) dögevő legyekből vontak ki és szekvenáltak emlős-DNSt. Schnell és mtsai (14) Vietnamban gyűjtött piócákból vontak ki vért, és ebből mutattak ki több veszélyeztetett emlősfajt. Az élő piócákból hónapokon keresztül lehetséges volt az emlős-DNS kimutatása. Galan és mtsai (15) ragadozó-ürülékből és bagolyköpetből azonosítottak rágcsálókat. Razgour és mtsai (16) közel 80 ízeltlábú-fajt azonosítottak denevérürülékből. Boyer és mtsai (17) egy veszélyeztetett szárazföldi ragadozó csiga táplálékfajait azonosították, szintén ürülékből (érdemes megnézni, hogyan vadászik egy csiga). A nem invazív metabarcoding esetében felmerülő kérdések főleg a nagyon kis mennyiségű, nagyon degradáló környezetben található DNS megőrzésére, értékelhetőségére vonatkoznak. Lehetséges-e egy kaszálón lekaszált szénából kivont DNS alapján következtetni az ott élő állatokra? Lehetséges-e a denevérek ürüléke alapján megbízható gerinctelen-monitoringot folytatni? Milyen pontossággal és teljességgel mutathatóak ki a vízi közösségek egy vízmintából? Mennyire fontos, hogy az nem invazív metabarcoding hasonló közösség-struktúrát mutasson, mint az invazív metabarcoding, vagy az egyed-alapú monitoring? A valószínű eltérések ellenére bekalibrálható a módszer arra, hogy megválaszoljon fontos természetvédelmi kérdéseket?
A környezeti DNS területe most kezd túllépni az új generációs DNS-szekvenálás lehetőségeinek kezdeti eufóriáján. Egyre több problémamegoldó, konceptuális, a módszert ökológiai kérdésekre alkalmazó kutatás jelenik meg. Az elkövetkező néhány évben szerintem a konszolidáció lesz az uralkodó: egyre nagyobb hangsúly lesz a probléma-megoldáson, a módszertanilag-ökológiailag informált kérdésfeltevésen, az szekvencia-adatbázisok fejlesztésén, a jobb kvantifikációt biztosító módszereken, a közösségrekonstrukciók hitelesítésének fontosságán. A biodiverzitás-kutatás szempontjából mindenképp izgalmas évek következnek, bár a környezeti DNS módszerek valószínűleg sosem fognak teljes alternatívát jelenteni az invazív ökológiai mintavételezésre. A metabarcoding a mintafeldolgozás leegyszerűsítésével mindenképp hozzájárul majd olyan munkákhoz, amelyek taxonómiailag átfogó, magasan replikált mintavételezést igényelnek.

Bálint Miklós

Felhasznált irodalom:

1. Frosch C, Haase P, Nowak C (2011) First set of microsatellite markers for genetic characterization of the Eurasian beaver (Castor fiber) based on tissue and hair samples. European Journal of Wildlife Research 57:679–682.
2. Harms V, Steyer K, Frosch C, Nowak C (2011) Wolfsforschung im Molekularlabor – Senckenberg ist nationales Referenzzentrum für Wolfsgenetik. Senckenberg - Natur, Forschung, Museum 141:174–181.
3. Collins RA, Armstrong KF, Holyoake AJ, Keeling S (2012) Something in the water: biosecurity monitoring of ornamental fish imports using environmental DNA. Biological Invasions 15:1209–1215.
4. Strand DA et al. (2011) Detection and quantification of the crayfish plague agent in natural waters: direct monitoring approach for aquatic environments. Diseases of Aquatic Organisms 95:9–17.
5. Ishii S, Segawa T, Okabe S (2013) Simultaneous quantification of multiple food- and waterborne pathogens by use of microfluidic quantitative PCR. Applied and Environmental Microbiology 79:2891–2898.
6. Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 270:313–321.
7. Gill S et al. (2006) Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science 312:1355–1359.
8. Anjuli Meiser, Miklós Bálint, Imke Schmitt (2014) Meta-analysis of deep-sequenced fungal communities indicates limited taxon sharing between studies and presence of biogeographic patterns. New Phytologist in press.
9. Ji Y et al. (2013) Reliable, verifiable and efficient monitoring of biodiversity via metabarcoding. Ecology Letters 16:1245–1257.
10. Hajibabaei M, Shokralla S, Zhou X, Singer GAC, Baird DJ (2011) Environmental barcoding: a next-generation sequencing approach for biomonitoring applications using river benthos. PLoS ONE 6:e17497.
11. Wang J et al. (2013) Environmental bio-monitoring with high-throughput sequencing. Brief Bioinform 14:575–588.
12. Hajibabaei M, Spall J, Shokralla S, van Konynenburg S (2012) Assessing biodiversity of a freshwater benthic macroinvertebrate community through non-destructive environmental barcoding of DNA from preservative ethanol. BMC Ecology 12:28.
13. Calvignac-Spencer S et al. (2013) Carrion fly-derived DNA as a tool for comprehensive and cost-effective assessment of mammalian biodiversity. Molecular Ecology 22:915–924.
14. Schnell IB et al. (2012) Screening mammal biodiversity using DNA from leeches. Current Biology 22:R262–R263.
15. Galan M, Pagès M, Cosson J-F (2012) Next-generation sequencing for rodent barcoding: species identification from fresh, degraded and environmental samples. PLoS ONE 7:e48374.
16. Razgour O et al. (2011) High-throughput sequencing offers insight into mechanisms of resource partitioning in cryptic bat species. Ecology and Evolution 1:556–570.
17. Boyer S, Wratten SD, Holyoake A, Abdelkrim J, Cruickshank RH (2013) Using next-generation sequencing to analyse the diet of a highly endangered land snail (Powelliphanta augusta) feeding on endemic earthworms. PLoS ONE 8:e75962.